बीज जीवक्षमता आंकलन हेतू टेट्राजोलियम परीक्षण

एक बीज को जीवक्षम (viable) माना जाता है जब वह जीवित होता है और संभावित रूप से अंकुरण में सक्षम होता है। जीवक्षमता/viability उस स्तर को दर्शाती है जिस तक एक बीज जीवित है, चयापचय रूप से सक्रिय हो और अंकुरण और अंकुर वृद्धि के लिए आवश्यक चयापचय प्रतिक्रियाओं को उत्प्रेरित करने में सक्षम एंजाइम उसके अन्दर मौजूद हो।

अनुकूल वातावरण मिलने पर भी अंकुरित होने में असमर्थ बीज या तो निष्क्रिय होता है या अजीवक्षम/ non-viable होते है। निष्क्रिय/ सुषुप्त बीज जीवित होते है तथा अनुकूल वातावरण मिलने पर अंकुरित हो जाते है बशर्ते की सुषुप्ता को प्राकृतिक या कृत्रिम रूप से समाप्त ना कर दिया गया होI इसके विपरीत अजीवक्षम बीज अनुकूल वातावरण मिलने या किसी भी प्रकार का बीजोपचार करने के उपरांत भी अंकुरित होने में असमर्थ होते हैI

बीज जीवक्षमता के आकलन के तरीके:

1. अंकुरण परीक्षण (Germination Test):

इस विधि में बीज की जीवक्षमता का आकलन ज्यादातर मानक अंकुरण परीक्षण द्वारा ही किया जाता है। यह खेतों में बीज की अंकुरण क्षमता या जीवक्षमता मापने की सबसे सरल विधि है परन्तु विभिन्न कारकों के कारण प्रयोगशाला परीक्षण से प्राप्त परिणाम आम तौर पर खेतों में देखे गए परिणामों से काफी भिन्न रहते हैं और इसके लिए अपेक्षाकृत लंबी अवधि की आवश्यकता होती है।

2. एक्साइज एम्ब्रियो परीक्षण (Excised embryo Test) :

धीमी अंकुरण वाले वृक्षों के बीज जिनमें अंकुरण धीमी गति से होता है या ऐसे बीज जिसमे सुषुप्ता अवस्था लम्बे समय तक रहती हो तथा पूर्ण अंकुरण परिक्षण के लिए 60 दिनों से अधिक की आवश्यकता होती है, की जीवक्षमता को कम समय में मापने के लिय इस विधि का प्रयोग किया जाता हैI

 इस विधि में, बीजों को 1-4 दिनों के लिए भिंगोया जाता है और फिर भ्रूणों को बीजों से निकाला जाता है और पेट्री डिश में नम फिल्टर पेपर या ब्लॉटर डिस्क पर रखा जाता है। इसके बाद बीजों को 20 डिग्री सेल्सियस के निरंतर तापमान पर प्रकाश में रखा जाता है तथा भ्रूण की स्थिति की रोजाना जांच की जाती है।

विभिन्न प्रजातियों के आधार पर इस विधि द्वारा बीज की जीवक्षमता को अधिकतम 14 दिनों में मापा जा सकता है या जैसे ही जीवक्षम और अजीवक्षम भ्रूण में स्पष्ट अंतर दिखाई देने लगे यह परिक्षण पूर्ण हो जाता हैI एक्साइज किया हुआ भ्रूण परीक्षण अंकुरण परीक्षणों के समान ही होता है जिसमें यह बीज की गुणवत्ता को उनके वास्तविक अंकुरण से मापता है।

परीक्षण पहले से अंकुरित बीजों के लिए मान्य नहीं होता है और उन नमूनों पर लागू नहीं किया जाना चाहिए जिनमें सूखे अंकुरित बीज हों। परीक्षण की सफलता के लिए परिक्षण करने वाले व्यक्ति में काफी कौशल और अनुभव की आवश्यकता होती है और  अंतर्राष्ट्रीय बीज परिक्षण संघ (ISTA) के नियम इसे केवल कुछ प्रजातियों तक ही सीमित रखते हैं।

3. टेट्राजोलियम परीक्षण (Tetrazolium Test):

यह परीक्षण 1940 के प्रारंभ में जर्मनी के प्रोफेसर जॉर्ज लैकॉन द्वारा विकसित किया गया था। इस परीक्षण को व्यापक रूप से बीज जीवक्षमता परीक्षण की आसान, सटीक और लोकप्रिय विधि के रूप में मान्यता प्राप्त है। इसे त्वरित परीक्षण भी कहा जाता है क्योंकि इसे कुछ ही घंटों में पूरा किया जा सकता है। परीक्षण कम समय में बड़ी मात्रा में बीज के प्रसंस्करण, संचालन, भंडारण और विपणन, निष्क्रिय बीज लॉट का परीक्षण और बीज लॉट की विगर रेटिंग में बहुत उपयोगी है, ।

टेट्राजोलियम परीक्षण सिद्धांत:

सभी जीवित ऊतक, जो श्वसन करते हैं, एक रंगहीन रसायन 2,3,5 ट्राइफेनिल टेट्राजोलियम क्लोराइड या ब्रोमाइड को लाल रंग के यौगिक 'फॉर्माज़ोन' में परिवर्तित करने में सक्षम होते हैं, जो एंजाइम डीहाइड्रोजीनेज द्वारा उत्प्रेरित एच ट्रांसफर प्रतिक्रियाओं के कारण होता है। इस प्रकार बीजों के लाल रंग के जीवित भागों को रंगहीन मृत बीजों से अलग करना संभव हो जाता है।

उपयोग का क्षेत्र:

यह परीक्षण पहले से अंकुरित बीजों के लिए मान्य नहीं है और इसे ऐसे प्रस्तुत नमूनों पर लागू नहीं किया जाना चाहिए जिसमें सूखे अंकुरित बीज होते हैं।

प्रतिक्रिया का तंत्र:

चूंकि एक बीज के भीतर पाए जाने वाले ऊतक जीवक्षमता के विभिन्न स्तरों में हो सकते हैं, इसलिए वे अलग-अलग तरह से स्टेन होते है। मूरे (1973) ने बीज के टोपोग्राफी स्वरुप के आधार पर टी जेड स्टैनिंग के उपयोग को अधिक कुशलता से वर्णित किया।

रासायनिक प्रतिक्रिया जो रंगहीन टेट्राजोलियम घोल को फॉर्मेज़ोन में बदल देती है:

अभिकर्मक (Reagent):

टेट्राजलियम घोल:

2, 3, 5-ट्रिफ्रिनाइल टेट्राजोलियम क्लोराइड या सामान्य रूप से इस्तेमाल होने वाले ब्रोमाइड का घोल 1.0% होना चाहिए। हालांकि, कम या अधिक प्रतिशत का घोल भी बनाया जा सकता है। तैयारी में आसुत/ विआयनीकृत (Distilled/ deionized) पानी का उपयोग किया जाना चाहिए, और TZ घोल का पीएच 6.5 और 7.5 के बीच होना चाहिए। आवश्यक सीमा के भीतर पीएच सुनिश्चित करने के लिए, फॉस्फेट बफर का उपयोग किया जाना चाहिए।

बफर घोल:

इसे आसुत/ विआयनीकृत (Distilled/ deionized)  जल का उपयोग करके बनाया जाना चाहिए:

घोल 1: 9.078 ग्रा. पोटेशियम डाई-हाइड्रोजन फॉस्फेट (KH₂PO₄) को 1000 मी.ली. आसुत/ विआयनीकृत (Distilled/ deionized)  जल में घोलें

घोल 2: 9.472 ग्रा. सोडियम डाई-हाइड्रोजन फॉस्फेट (Na₂HPO₄₎ को 1000 मी.ली.  आसुत/ विआयनीकृत (Distilled/ deionized) जल में घोलें, या 11.876 ग्रा. Na₂HPO₄ 2H₂O को 1000 मी.ली.  आसुत/ विआयनीकृत (Distilled/ deionized) जल में घोलें।

सही सांद्रता का घोल प्राप्त करने के लिए बफर में TZ के क्लोराइड या ब्रोमाइड आयनों की सही मात्रा को घोल दिया जाता है जैसे प्रति 100 मिलीलीटर बफर में 1g TZ मिलाने पर 1% का घोल बनता है। TZ घोल को अंधेरे में 5-10^oC पर एक वर्ष तक संग्रहीत किया जा सकता है। घोल को सीधे प्रकाश के संपर्क में नहीं लाना चाहिए क्योंकि इससे टेट्राजोलियम में पराभव (reduction) हो जाता है।

टेट्राजोलियम परीक्षण प्रक्रिया:

सभी ऊतकों के पूर्ण जलयोजन करने के लिए बीजों को पहले गीले आधार पर अन्तःशोषण/imbibe किया जाता है। कई प्रजातियों के लिए इस घोल  को सम्पूर्ण बीज पर उपयोग किया जा सकता है। अन्य बीजों को विभिन्न तरीकों से काटकर और पंचर करके तैयार किया जाना चाहिए ताकि टेट्राजोलियम के घोल को बीजों के सभी भागों तक पहुँचाया जा सके। जलयोजन के बाद बीजों को पूर्ण रंग के लिए टी जेड / TZ नमक के घोल में भिगोया जाता है।

अ. वर्किंग नमूने (working sample): नमूने के शुद्ध बीज अंश से यादृच्छिक रूप से निकाले गए 100 शुद्ध बीजों की चार प्रतिकृति/replication पर एक परीक्षण किया जाना चाहिए।

ब. बीज की तैयारी और उपचार: टी जेड घोल के आसान प्रवेश के लिए बीज तैयार किया जाना चाहिए।

बीज को पूर्व नमी देना:

कुछ प्रजातियों में स्टैनिंग के लिए यह आवश्यक प्रारंभिक कदम है और कुछ के लिए अत्यधिक अनुशंसित है। अन्तःशोषित /imbibe बीज आमतौर पर सूखे बीजों की तुलना में कम नाजुक होते हैं और इन्हें अधिक तेजी से काटा या पंचर किया जा सकता है। यदि बीज कवच अन्तःशोषण को बाधित करता है, तो कवच को पंचर किया जाना चाहिए।

i) धीमी नमी: अंकुरण परीक्षण के लिए प्रयुक्त विधि के अनुसार बीज को कागज के ऊपर या कागज के बीच में अन्तःशोषित/ imbibe किया जाता है। इस तकनीक का उपयोग उन प्रजातियों के बीजों के लिए किया जाना चाहिए जो सीधे पानी में डूबे होने पर टूटने की प्रवृत्ति रखते हैं (जैसे) बड़े बीज वाली दलहनी फसलों के बीज, सोयाबीन के बीज और अन्य बड़े बीजों को जब सीधे पानी या टी जेड घोल में रखा जाता इतनी तेजी से और अनियमित रूप से फूल सकती है कि बीज आवरण फट जाते हैं। इसलिए, इन बीजों को स्टेन होने से पहले रात भर नम कागज़ में धीरे-धीरे भींगोना चाहिए, ताकि वे बिना किसी नुकसान के नमी को धीरे-धीरे अवशोषित कर सकें।

ii) पानी में भिगोना: बीज को पूरी तरह से पानी में डुबो देना चाहिए और पूरी तरह से सोखने तक छोड़ देना चाहिए। यदि भिगोने की अवधि 24 घंटे से अधिक है, तो पानी को बदल देना चाहिए।

स्टैनिंग से पहले ऊतकों का एक्सपोजर:

टी जेड घोल के आसान प्रवेश के लिए और मूल्यांकन की सुविधा के लिए स्टेन होने से पहले ऊतकों को उजागर करना आवश्यक है।

i) बीज को छेदना:

पहले से सिक्त या कठोर बीजों को सुई या तेज छुरी का उपयोग करके बीज के गैर-आवश्यक भाग में छेदना चाहिए।

ii) अनुदैर्ध्य काटना :

• सभी अनाजों और घासों के बीजों के लिए: भ्रूणीय अक्ष के मध्य से होकर भ्रूणपोष की लंबाई के तीन चौथाई भाग से होकर
• भ्रूणपोष रहित द्विबीजपत्री बीजों के लिए और सीधे भ्रूण के साथ बीजपत्रों के बाहर के आधे भाग के बीच से चीरा लगाना चाहिए, जिससे भ्रूण की धुरी बिना काटे रह जाए।
• बीज में जहां जीवित ऊतक से घिरा हुआ भ्रूण होता है, भ्रूण के साथ एक अनुदैर्ध्य कटिंग सुरक्षित रूप से की जा सकती है

iii) अनुप्रस्थ कटिंग:

स्केलपेल, रेजर ब्लेड आदि का उपयोग करके गैर-आवश्यक ऊतकों के माध्यम से कटिंग की जाती है

• अनुप्रस्थ चीरा: अनुप्रस्थ कट के विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और यह छोटे घास प्रजाति के बीज के लिए अच्छा तरीका है
• भ्रूण का छांटना: भ्रूण को एक विदारक लैंसेट के साथ एक्साइज किया जाता है (उदाहरण के लिए) होर्डियम, सेकेल और ट्रिटिकम के बीज में
• बीज आवरण को हटाना: कुछ प्रजातियों में पूरे बीज आवरण और किसी भी अन्य आवरण ऊतक को हटा दिया जाना चाहिए। (उदाहरण के लिए) टेट्राजोलियम के लिए अभेद्य बीज आवरण वाले द्विबीजपत्री बीज।

iv) अनुप्रस्थ चीरा:

अनुप्रस्थ कट के विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और यह छोटे घास प्रजाति के बीज के लिए अच्छा तरीका है

v) भ्रूण का छांटना:

भ्रूण को एक विदारक लैंसेट के साथ एक्साइज किया जाता है (उदाहरण के लिए) होर्डियम, सेकेल और ट्रिटिकम के बीज में

vi) बीज आवरण को हटाना:

कुछ प्रजातियों में पूरे बीज आवरण और किसी भी अन्य आवरण ऊतक को हटा दिया जाना चाहिए। (उदाहरण के लिए) टेट्राजोलियम के लिए अभेद्य बीज आवरण वाले द्विबीजपत्री बीज।

स. स्टैनिंग:

तैयार बीज या भ्रूण को पूरी तरह से टी जेड/ TZ घोल में डुबो देना चाहिए। छोटे बीज, जिन्हें संभालना मुश्किल होता है, उन्हें पहले से गीला किया जा सकता है और कागज की एक पट्टी पर तैयार किया जा सकता है, जिसे बाद में मोड़ा जाता है और टी जेड/ TZ घोल में डुबोया जाता है। स्टैनिंग तापमान 20-40^oC के बीच में होना चाहिए। विभिन्न प्रकार के बीजों, तैयार करने के विभिन्न तरीकों और विभिन्न तापमानों (<1 घंटा से 8 घंटे) के लिए स्टेन होने का समय अलग-अलग होता है। स्टेन होने की अवधि के अंत में घोल को छान लिया जाता है और बीज को पानी से धोया जाता है और जांच की जाती है

द. मूल्यांकन:

एक सामान्य टी जेड स्टेन में चेरी लाल दिखाई देता है।

• TZ परीक्षण का मुख्य उद्देश्य जीवक्षम और अजीवक्षम बीजों में अंतर करना है। प्रत्येक बीज की जांच की जाती है और स्टैनिंग पैटर्न और ऊतक की सुदृढ़ता के आधार पर जीवक्षम या अजीवक्षम के रूप में मूल्यांकन किया जाता है। एक जीवक्षम बीज को उन सभी ऊतकों में स्टेन दिखना चाहिए जिनकी जीवक्षमता सामान्य अंकुर विकास के लिए आवश्यक है।
• TZ परीक्षण को अक्सर स्थलाकृतिक/ topographical TZ परीक्षण कहा जाता है क्योंकि स्टैनिंग का पैटर्न या स्थलाकृति इसकी व्याख्या का एक महत्वपूर्ण पहलू है। स्टेन पैटर्न भ्रूण के जीवित और मृत क्षेत्रों को प्रकट करता है और विश्लेषक को यह निर्धारित करने में सक्षम बनाता है कि क्या बीजों में सामान्य अंकुर पैदा करने की क्षमता है।
• क्या एक बीज को जीवक्षम या अजीवक्षम दर्जा दिया गया है, यह सीधे एक सामान्य अंकुर के उद्भव और विकास के लिए जिम्मेदार विभिन्न बीज ऊतकों के महत्व से प्राप्त होता है।
• अधिकांश बीजों में आवश्यक और गैर-आवश्यक ऊतक होते हैं। आवश्यक संरचनाएं सामान्य पौध के विकास के लिए आवश्यक विभज्योतक और सभी संरचनाएं हैं।
• जीवक्षम बीज वे हैं जो सामान्य पौध पैदा करने की क्षमता दिखाते हैं। ऐसे बीज पूरी तरह से स्टेन हो जाते हैं, या यदि केवल आंशिक रूप से स्टेन होते हैं, तो स्टैनिंग पैटर्न इंगित करता है कि आवश्यक संरचनाएं जीवक्षम हैं।
• कठोर बीज पानी-अभेद्य बीज आवरण वाले बीज होते हैं और पहले से गीला होने के बाद भी कठोर रहते हैं।
• एक जीवक्षम बीज को अपनी जैव रासायनिक गतिविधि से एक सामान्य अंकुर पैदा करने की क्षमता दिखानी चाहिए। एक अजीवक्षम बीज ऐसी प्रकृति की कमियों या असामान्यताओं को दर्शाता है जो एक सामान्य अंकुर में इसके विकास को रोकते हैं।
• पूरी तरह से स्टेन जीवक्षम बीजों और पूरी तरह से बिना स्टेन वाले अजीवक्षम बीजों के अलावा, आंशिक रूप से स्टेन वाले बीज भी हो सकते हैं।
• आंशिक रूप से स्टेन वाले इन बीजों के विभिन्न क्षेत्रों में परिगलित ऊतक के भिन्न-भिन्न अनुपात पाए जाते हैं।
• नेक्रोटिक क्षेत्र की स्थिति और आकार, ना कि स्टैनिंग रंग की तीव्रता यह निर्धारित करती है कि ऐसे बीजों को जीवक्षम या अजीवक्षम के रूप में वर्गीकृत किया गया है या नहीं।
• आवर्धक उपकरणों की सहायता से बीजों का मूल्यांकन किया जाता है। अलग-अलग बीज का मूल्यांकन जीवित या मृत के रूप में भ्रूण में स्टैनिंग पैटर्न के आधार पर किया जाता है, जिसके बाद बीजपत्र को देखा जाता हैं।

a) भ्रूण के स्टैनिंग के आधार पर आकलन:

• भ्रूण पूरी तरह से स्टेन- जीवित
• भ्रूण स्टेन रहित – मृत
• प्लम्यूल या रेडिकल अनस्टैन्ड- मृत /नॉन वायबल

b) बीजपत्र के आधार पर मूल्यांकन:

• पूर्ण स्टैनिंग- जीवित
• कोई स्टैनिंग नहीं - मृत
• नेक्रोसिस- श्रेणी के आधार पर मूल्यांकन

c) परिगलन/ नेक्रोसिस के आधार पर आकलन:

• भ्रूण के अटैचमेंट पर बिना स्टेन वाले ऊतक - मृत
• बिना स्टेन वाले ऊतक दूर होते हैं और क्षेत्र भ्रूण से जुड़ा नहीं होता है- जीवित

d) रंग तीव्रता के आधार पर आकलन:

• गहरा लाल - विगरस बीज
• गुलाबी रंग-कमजोर बीज
• गहरा लाल खंडित – मृत

गणना:

परीक्षण किए गए कुल बीजों के संबंध में परिणामों को जीवित बीजों के प्रतिशत के रूप में सूचित किया जाता है।

फायदे और नुकसान:

• बीज जीवक्षमता का कम समय में मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है
• सुषुप्त और असुषुप्त बीजों के लिए उपयोगी होता है
• अंकुरण परीक्षण तत्काल अंकुरण का प्रतिशत बताता है जबकि टी जेड/ TZ परीक्षण जीवित बीज का प्रतिशत बताता है और TZ परीक्षण और अंकुरण परीक्षण के बीच का अंतर निष्क्रिय बीज के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है।
• जब फसल के तुरंत बाद बीज बोना होता है
• गहरे सुषुप्तवस्था वाले बीजों में एवं धीमी गति से अंकुरण दिखाने वाले बीजों में
• ऐसे मामलों में जहां अंकुरण क्षमता का बहुत जल्दी अनुमान लगाने की आवश्यकता होती है
• अंकुरण परीक्षण के अंत में अलग-अलग बीजों की जीवक्षमता का निर्धारण करने के लिए, विशेष रूप से जहां सुषुप्तवस्था का संदेह है। परीक्षण जब अंकुरण परीक्षण के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है, तो यह निष्क्रिय बीज के परीक्षण के लिए उपयोगी हो सकता है।
• अंकुरण और विभिन्न प्रकार की कटाई और प्रसंस्करण क्षति (उष्म क्षति, यांत्रिक क्षति, कीट क्षति) की उपस्थिति का पता लगाने के लिए
• इसकी निष्क्रियता का पता न लगना कभी-कभी नुकसान के रूप में उद्धृत किया जाता है
• इसकी सही व्याख्या करने के लिए आवश्यक कठिनाई और पर्याप्त अनुभव का होना

Reference cited:

1. Dhirendra Khare and Mohan S. Bhale (2005). Seed Technology. Scientic Publishers, Jodhpur.
2. ISTA (2015), Introduction to the ISTA Rules Chapters 1-19. International Rules for Seed Testing, Vol.2015, Full Issue i-19-8 (276) Published by The International Seed Testing Association (ISTA) Zurichstr, Switzerland. http://doi.org/10.15258/2015.F
3. K Agrawal and M. Dadlani (2010). Techniques in Seed Science and Technology. South Asian publishers, New Delhi, International Book Company, Absecon Highlands, N.J.
4. L. Agrawal (2012). Seed Technology. Oxford & IBH Publishing Co. Pvt. Ltd., New Delhi.

Authors:

कल्याणी कुमारी, विशाल त्यागी, श्री पति के. वी., उदय भास्कर के., सुस्मिता सी एवं बनोत विनेष

भारतीय बीज विज्ञान संस्थान, कुसमौर, मऊ (ऊ.प्र.)

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