आक्रमणकारी विदेशी डीएनए की प्रतिक्रिया में CRISPR-Cas9 प्रणाली की क्रिया को तीन चरणों में विभाजित किया जा सकता है:

(i) अधिग्रहण चरण - आक्रमणकारी डीएनए की पहचान की जाती है और लक्ष्य डीएनए से प्राप्त स्पेसर अनुक्रम को स्थापित करने के लिए मेजबान CRISPR सरणी में डाला जाता है। प्रतिरक्षाविज्ञानी स्मृति;

(ii) अभिव्यक्ति चरण - Cas9 प्रोटीन व्यक्त किया जाता है, और CRISPR सरणी को एक अग्रदूत आरएनए प्रतिलेख (precrRNA) में स्थानांतरित किया जाता है।  एक नॉनकोडिंग ट्रांस-एक्टिवेटिंग सीआरआईएसपीआर आरएनए (सीआरएनए) फिर प्री-सीआरएनए और कैस9 प्रोटीन में संकरण करता है और उन्हें परिपक्व आरएनए इकाइयों में संसाधित करता है जिन्हें सीआरआरएनए के रूप में जाना जाता है; और

(iii) हस्तक्षेप चरण - परिपक्व सीआरआरएनए उचित डीएनए लक्ष्य को पहचानने के लिए कैस9 प्रोटीन का मार्गदर्शन करता है, जिससे हमलावर विदेशी डीएनए की दरार और गिरावट होती है। Cas9 प्रोटीन डबल स्ट्रैंड ब्रेक (DSB) उत्पन्न करने के लिए डीएनए को काटता है, जिससे सेलुलर डीएनए मरम्मत तंत्र शुरू हो जाता है।  एक समजात मरम्मत टेम्पलेट की अनुपस्थिति में, त्रुटि-प्रवण गैर समजात अंत जुड़ाव (एनएचईजे) मार्ग सक्रिय होता है और डीएसबी साइट पर यादृच्छिक सम्मिलन/ हटाना या यहां तक कि प्रतिस्थापन भी पेश करता है, जिसके परिणामस्वरूप आम तौर पर जीन फ़ंक्शन में व्यवधान होता है।

वैकल्पिक रूप से, यदि डीएसबी साइट के आस-पास के अनुक्रम के अनुरूप दाता डीएनए टेम्पलेट उपलब्ध है, तो त्रुटि मुक्त होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) मार्ग शुरू किया जाता है, जिससे उत्परिवर्तन होता है जो जीन नॉक-इन, विलोपन या उत्परिवर्तन सहित सटीक जीन संशोधन करता है।

बागवानी फसलों के सुधार में सीआरआईएसपीआर का अनुप्रयोग

इस तकनीक का उपयोग विभिन्न बागवानी फसलों में तनाव प्रतिरोध बढ़ाने, फलों की गुणवत्ता के साथ-साथ मात्रा, पोषण, रंग आदि में सुधार के लिए किया गया है। जैविक और अजैविक तनाव दोनों ही फसल के बड़े नुकसान का कारण बनते हैं, और जीन संपादन तकनीक इनके समाधान के लिए एक नया अवसर लाती है। पिछले अध्ययन में, CRISPR/Cas9-मध्यस्थता संपादन द्वारा टमाटर में SLs बायोसिंथेसिस एंजाइम कैरोटीनॉयड क्लीवेज डाइऑक्सीजिनेज 8 (CCD8) CCD8 या अधिक एक्सिलरी ग्रोथ 1 (MAX1) जीन का उत्परिवर्तन ब्रूमरेप्स के खिलाफ प्रतिरोध प्रदान करता है। डिज़ाइन किए गए CRISPR/Cas9 वेक्टर लक्ष्यीकरण वायरस जीन ने टमाटर में टोमैटो येलो लीफ कर्ल वायरस (TYLCV) और केले में एंडोजेनस बनाना स्ट्रीक वायरस (eBSV) के खिलाफ हस्तक्षेप प्रदान किया।

एक अन्य अध्ययन में, साइट्रस एस जीन लेटरल ऑर्गन बाउंड्रीज़ 1 (एलओबी1) को लक्षित करने वाले डिज़ाइन किए गए सीआरआईएसपीआर/कैस9 वैक्टर को साइट्रस पौधों में स्थानांतरित किया गया और ऐसे उत्परिवर्ती उत्पन्न किए गए जो ज़ैंथोमोनास सिट्री सबस्प के प्रतिरोधी थे। सिट्रियस। खीरे में एक अध्ययन से पता चला है कि CRISPR/Cas9 प्रणाली के साथ S जीन यूकेरियोटिक ट्रांसलेशन इनीशिएशन फैक्टर 4E (eIF4E) के उत्परिवर्तन से खीरे की नस को पीला करने वाले वायरस (CVYV), ज़ुचिनी पीले मोज़ेक वायरस (ZYMV), और पपीता रिंगस्पॉट के खिलाफ व्यापक रोग प्रतिरोधक क्षमता में काफी सुधार हुआ है। मोज़ेक वायरस-डब्ल्यू (पीआरएसवी-डब्ल्यू)। बैक्टीरिया ज़ैंथोमोनस एक्सोनोपोडिस (साइट्रस एक्स साइनेंसिस) द्वारा मीठे संतरे के साइट्रस नासूर के प्रति संवेदनशीलता को नियंत्रित करने के लिए एक उम्मीदवार जीन के रूप में CsLOB1 और CsLOB1 जीन के संपादन के परिणामस्वरूप हाइब्रिड प्रोलाइन के स्थिर रूप से परिवर्तित संपादित लाइनों CRISPR/Cas9-आधारित सटीक छांटना के बीच अलग-अलग प्रतिरोध प्रतिक्रियाएं हुईं- समृद्ध प्रोटीन 1 (HyPRP1) डोमेन के परिणामस्वरूप खेती किए गए टमाटरों में नमक तनाव सहनशीलता आई।

लेटरल ऑर्गन बाउंड्रीज़ डोमेन 40 (एलबीडी40) नॉकआउट पौधों ने टमाटर में सूखा सहनशीलता में उल्लेखनीय वृद्धि की। इसके अलावा, नॉक आउटिंग सी-रिपीट बाइंडिंग फैक्टर (सीबीएफ) ने टमाटर की ठंड सहनशीलता को कम कर दिया। जिबरेलिन बायोसिंथेसिस जीन, MaGA20ox2 को "ग्रोस मिशेल" कल्टीवेर में CRISPR/Cas9 प्रणाली का उपयोग करके सफलतापूर्वक संपादित किया गया, जिसके परिणामस्वरूप एक अर्ध-बौना उत्परिवर्ती कल्टीवेर प्राप्त हुआ।

CRISPR/Cas9 तकनीक का उपयोग करके GABA बायोसिंथेसिस एंजाइम ग्लूटामिक एसिड डिकार्बोक्सिलेज़ 2 (GAD2) और GAD3 के ऑटोइनहिबिटरी डोमेन को हटाकर टमाटर GABA सामग्री को बढ़ाया गया था। CRISPR/Cas9 की मदद से, फल स्थान संख्या और आकार निर्धारित करने में ENO जीन का लक्षण वर्णन टमाटर की किस्मों में सुधार के आणविक प्रजनन कार्यक्रम में एक मील का पत्थर प्रतीत होता है।

एक अध्ययन में बताया गया है कि CRISPR/Cas9 के माध्यम से CEN-जैसे जीन AcCEN4 और AcCEN के उत्परिवर्तन ने एक चढ़ने वाले वुडी बारहमासी कीवीफ्रूट को बदल दिया, जिसे एक्सिलरी पुष्पक्रम और फल विकसित करने में कई साल लगते हैं, एक साल के भीतर टर्मिनल फूल और फल के विकास के साथ एक कॉम्पैक्ट पौधे में बदल जाता है।

चुनौतियाँ और भविष्य के दृष्टिकोण

हालाँकि पारंपरिक फसल प्रजनन की तुलना में जीनोम संपादन के कई फायदे हैं, लेकिन बागवानी फसलों में इसके अनुप्रयोग के लिए कुछ चुनौतियाँ बनी हुई हैं। बागवानी फसलों में, आणविक और आनुवंशिक अध्ययन कठिन होते हैं, जो वांछनीय लक्षणों के लिए जिम्मेदार जीन की पहचान में बाधा डालते हैं। वांछनीय लक्षणों से जुड़े जीन की पहचान के लिए रुचि की बागवानी फसलों के जीनोम का अनुक्रमण महत्वपूर्ण होगा।

इस तकनीक का उपयोग कई फसलों में तेजी से किया जा रहा है, बागवानी फसलों के प्रजनन में इसके व्यापक उपयोग के लिए तीन चुनौतियों से निपटने की आवश्यकता होगी। सबसे पहले, उपभोक्ताओं, प्रजनकों और जीवविज्ञानियों के बीच संचार के माध्यम से संबंधित बागवानी फसल के स्पष्ट प्रजनन लक्षणों की पहचान की जानी चाहिए। दूसरा और तीसरा, संपादन अभिकर्मकों को वितरित करने और बाद में म्यूटेंट को पुनर्जीवित करने के लिए उपयुक्त तरीके विकसित किए जाने चाहिए।

संपादन क्षमता में परिशोधन, नए उपकरणों का विकास, सीआरआईएसपीआर/कैस सिस्टम की डिलीवरी में नवाचार, परिवर्तन प्रोटोकॉल की स्थापना, और वंशानुगत म्यूटेंट की आसान पहचान अधिक व्यावसायिक फसलों में जीन संपादन प्रयासों को आगे बढ़ाने की प्रमुख संभावनाएं होंगी। इन सुधारों को एकीकृत करते हुए, सीआरआईएसपीआर/कैस जीन संपादन नई तनाव प्रतिरोधी किस्मों को विकसित करने, सटीक प्रजनन में एलील्स, बेहतर उपज वाली फसल, रोगजनकों के खिलाफ सुरक्षा और भविष्य में पोषण मूल्य बढ़ाने के लिए आकर्षक उपकरण होगा।

चित्र 1 बागवानी फसलों में विभिन्न लक्षणों में सुधार के लिए सीआरआईएसपीआर/सीएएस का अनुप्रयोग

सार:

बागवानी फसलें कई अन्य मूल्यवान उत्पादों के साथ-साथ भोजन का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा और पोषण स्रोत भी हैं। हालाँकि, जलवायु परिवर्तन, बीमारियाँ और प्रतिकूल पर्यावरणीय परिस्थितियाँ उनकी गुणवत्ता और उत्पादकता को प्रभावित करके गंभीर संकट पैदा करती हैं।

हाल ही में विकसित नई पीढ़ी का प्रजनन उपकरण क्लस्टर्ड रेगुलरली इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट/सीआरआईएसपीआर संबद्ध 9 (सीआरआईएसपीआर/कैस9) अन्य मौजूदा आणविक प्रजनन उपकरणों की तुलना में अपनी सादगी, उच्च दक्षता और सटीकता के कारण फसल सुधार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

CRISPR/Cas9 तकनीक की खोज ने अवांछनीय जीन को खत्म करना या वांछित अतिरिक्त जीन टुकड़ों को अंदर लाना संभव बना दिया है, इसके अलावा यह एकल न्यूक्लियोटाइड परिवर्तनों को शुरू करके जीनोम को सटीक रूप से संशोधित कर सकता है।

इसमें समय भी कम लगता है और बाजार में इसे व्यावसायिक रूप से आसानी से स्वीकार किया जाता है। इस लेख में बागवानी फसल में जीनोम संपादन के अनुप्रयोग में हालिया प्रगति और चुनौतियों का सारांश दिया गया है।

Autjors:

अखिल कुमार¹ और शिवानी शर्मा²

¹जैव प्रौद्योगिकी विभाग, डॉ. यशवन्त सिंह परमार बागवानी एवं वानिकी विश्वविद्यालय, नौणी, सोलन (हि.प्र.), भारत

²बायोकेमिस्ट्री विभाग, कॉलेज ऑफ़ बेसिक साइंसेज, चौधरी सरवन कुमार हिमाचल प्रदेश कृषि विश्वविद्यालय, पालमपुर

ईमेल: This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.